曹修岭 于嘉林 中国农业大学
在植物基因工程操作中有一类基因通常并非我们希望在我们的最终产物中存在，但是在我们操作的过程中我们却离不开它们。它们的作用就相当于一个标签，让我们能够在我们操作的成千上万个细胞中选出那很少的几个已经符合我们条件的细胞，然后我们把这少量的符合条件的细胞进行精心培养，使其正常生长为完整的植株。这类具有标签作用的基因我们就称为选择标记基因。 可以看出选择标记基因在基因工程操作中的重要性。想象一下如果没有选择标记基因作为标签指示作用，基因工程操作的难度会有多大。在一次处理的上万个细胞中，真正能够符合我们要求的或许只有几个，如果一定要一个一个的检查哪个是符合我们要求的，无异于大海捞针，这样的工作量几乎是不可能完成的任务。如果是某些人非要一个一个的检查，那得需要多大的物力财力。即使最后得到了想要的细胞，培养成植株，他的付出也是得不偿失的。 选择标记基因并非一类特定的基因，也就是说并不是一些东西天生就是作为选择标记基因而没有其他的用处。只要在我们的基因工程操作过程中能够充当一个标签的作用，并且使我们的操作能够方便简单，符合我们条件的基因都可以作为选择标记基因。 所以符合以上要求能够作为选择标记基因的有很多。在基因工程的不断发展过程中，随着科学技术各个分支的不断发展和人们对基因功能认识的不断深入，选择标记基因也处在不断发展完善的过程中。到现在为止在基因工程操作中大量应用的选择标记基因大体可以分为四类，分别是抗生素抗性基因、除草剂抗性基因，化合物解毒酶基因和植物糖类代谢酶基因。它们在相应的选择培养基上都可以起到标签的作用，使得符合我们条件的细胞能够突出的显现出来。下面我们就分别举例介绍一下这四类选择标记基因的作用原理和各自的特点。 1．抗生素抗性的选择标记基因 这类选择标记基因是通过编码一种或多种酶来解除抗生素的毒性，使得已经转入了此选择标记基因，以及和此选择标记基因连在一起的我们想要转入基因的细胞，在有抗生素存在的情况下能够存活。我们将此类存活的细胞进行培养，然后就能得到转入我们想要基因的植株。而那些没有转入此选择标记基因以及和此选择标记基因连在一起的我们想要转入基因的细胞，就不能编码这种解毒的酶而在有抗生素的培养基中死去。这样我们在基因工程操作中将转化完的所有细胞都放到含有相应抗生素的培养基上培养，那些能够存活的细胞就是我们想要得到的细胞了。 抗生素抗性基因和其对应的抗生素构成一个筛选体系。利用抗生素抗性基因进行细胞转化，利用含有其对应抗生素的培养基筛选出那些转化成功的细胞。现在常用的抗生素抗性的选择标记基因有：新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)，潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)，氯霉素磷酸转移酶基因(cat)，链霉素磷酸转移酶基因(spt)等。这些抗性基因与其对应的抗生素构成各自的筛选体系。不同的筛选体系有不同的特点，在基因工程中各有各的应用领域。 新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)与G418筛选体系：G418属于氨基糖苷类抗生素。该类抗生素能干扰植物细胞叶绿体及线粒体中蛋白质的合成，从而影响植物的光合作用和能量代谢，导致植物细胞死亡。新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)编码的新霉素磷酸转移酶能够修饰该类抗生素分子，从而影响该类抗生素功能的发挥而使抗生素失活。所以在含有G418的培养基上，只有那些转化成功的细胞能够存活下来，而没有转化成功的细胞则因能量代谢受到影响而死亡。 新霉素磷酸转移酶基因在植物遗传转化中应用的最早，Bevan. M.W等人在1983已将其用作植物遗传转化的标记基因。美国食品和药物管理局（FDA）在1994批准的首例商业化应用的转基因延熟番茄即是用的该基因作为标记基因。目前，该基因仍然是最常用的转基因植物选择标记基因。 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和潮霉素B筛选体系：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)编码的潮霉素磷酸转移酶(HPT)能够解除抗生素潮霉素B的毒性而起到选择标记的作用。潮霉素B在植物基因工程中的应用有对愈伤的选择效果明显，并且对植株的分化影响小等优点。潮霉素磷酸转移酶和潮霉素B在植物基因工程中已经发展成为一个非常有效，作用广泛的筛选体系，在单子叶植物，双子叶植物，裸子植物中均有应用。在哺乳动物中应用亦十分广泛。 2．除草剂抗性的选择标记基因 这类基因能够赋予转化成功的个体抗除草剂的性状。相比于抗生素抗性的筛选体系，除草剂抗性的筛选体系在转基因植株后代纯化筛选中有其独到的优势。近年来被广泛用作选择标记基因的除草剂抗性基因常用的有：epsps基因，bar 基因，gox基因等。 Epsps基因和草甘膦筛选体系：epsps基因编码的酶称为5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，该酶在植物自身氨基酸合成过程中发挥重要作用，该酶的缺失会造成植物因氨基酸的缺乏而死亡。草甘膦是目前世界上使用最广泛的除草剂之一，它能特异性地抑制植物中该酶的活性,阻断氨基酸的合成, 造成氨基酸的缺乏, 从而导致植株死亡。 Epsps基因是植物体内的一个正常基因，其编码的酶也是植物体内一个正常存在的酶。当草甘膦的浓度达到一定的量时，就能抑制植物体内大部分该酶的活性，使得植物因缺乏氨基酸而死亡。但当我们将能够过量表达该酶的突变基因转入植物以后，在一定的草甘膦浓度下，转入过量表达该酶突变基因的细胞内就会有一部分该酶不会被抑制而能正常合成氨基酸，正常生长。而那些没有成功转入此基因的细胞就会因酶的活性全部被抑制而死亡。这样我们要转入的基因就会因与此突变基因连在一起而存在于那些存活的细胞中。我们将这些存活的细胞挑出进行培养就能得到转基因植株。 在后续的操作中，我们将得到的转基因植株的后代种子种在地里，只需要喷一遍一定浓度的草甘膦就能将那些在遗传重组中丢失了相应基因的植株淘汰掉而保留下那些仍然含有该基因的植株，这样经过几代选择我们就能得到能够应用的种子材料了。这也是除草剂抗性基因和除草剂筛选体系的独特优点。在后续的纯化筛选中操作简便易行。目前,该筛选体系已经应用于大豆、小麦等的基因工程中。 另外，bar基因和草丁膦筛选体系是目前应用最广泛的除草剂类选择标记筛选体系。其作用机制和上面介绍的抗生素筛选体系的作用机制有些相似，这里不再介绍。自1986年分离和克隆了该基因以来，已广泛用于各种植物转化。目前，bar基因在水稻、玉米等20多种植物的遗传转化都有应用。 3．化合物解毒酶选择标记基因 这类标记基因的作用机制和抗生素抗性标记基因、除草剂选择标记基因相似，标记基因编码产物是酶,可催化对细胞生长有毒的化合物转变成无毒的化合物，从而使得转化成功的细胞能在含有有毒化合物的培养基上生长，而没能转入相应选择标记基因的细胞则被杀死。下面就来看两个例子。 来源于甜菜的碱醛脱氢酶(BADH)基因编码的碱醛脱氢酶(BADH)在植物中能催化有毒的甜菜碱醛转变成无毒的甜菜碱，可作为安全的标记基因应用于植物基因工程中。2001年Daniell等以甜菜碱醛脱氢酶基因作为选择标记基因，应用于烟草叶绿体基因组的基因工程操作中获得成功。 谷氨酸-1-半醛转氨酶(GSA-AT)基因也是一种化合物解毒酶选择标记基因。GSA-AT是植物体内叶绿素生物合成途径中的一个酶。 Gabaculine是一种植物毒素,它能强烈地抑制GSA-AT的活性，从而导致叶绿素的生物合成发生中断。hemL是一个具有Gabaculine抗性的GSA-AT突变基因。细胞中转入hemL基因后可以产生对Gabaculine的抗性。2001年Gough等以hemL基因为标记基因转化烟草成功。 化合物解毒酶选择标记基因与抗生素抗性和除草剂抗性选择标记基因相比有其自身的优势，因为大多数化合物解毒酶基因都是分离自天然植物中的基因，其编码的酶也都是将对植物有毒的化合物转化为无毒代谢物，这样不仅使其在基因工程操作过程中具有选择标记作用，其存在于转基因植物中也不会造成环境的污染和生态问题。 4．植物糖类代谢酶选择标记基因 糖类代谢酶选择标记基因是根据植物细胞对不同糖类碳源的代谢能力，近几年发展出的利用糖类作为筛选剂的筛选系统，在安全标记基因方面显示出巨大的应用潜力。 与抗生素类，除草剂类，化合物解毒酶基因这三类选择标记基因作用机制不同，糖类代谢酶选择标记基因编码产物是某种糖类的分解代谢酶，转化成功的细胞能利用相应糖类作为主要碳源，可在筛选培养基上生长。而没能成功转入相应糖类代谢酶基因的细胞不能利用此糖类，处于饥饿状态，生长受到抑制。这样利用选择剂糖类作为主要碳源的筛选培养基就能将成功转化的细胞在众多细胞中分离出来。 目前已用于植物基因工程的此类选择标记基因有木糖异构酶基因， 磷酸甘露糖异构酶基因和核糖醇操纵子，它们能分别使转化细胞利用木糖、6-磷酸甘露糖、核糖醇为碳源作为选择剂。下面就以木糖异构酶基因为例说明一下其作用机制。 木糖异构酶基因和D-木糖筛选系统：许多植物细胞不能代谢利用D-木糖，但可利用D-木酮糖。木糖异构酶能催化D-木糖转化为D-木酮糖。在以D-木糖为碳源的筛选培养基上，转化成功的细胞因能编码木糖异构酶，从而催化D-木糖转化为D-木酮糖，拥有充足碳源而获得优势生长。没能转入木糖异构酶基因的细胞则因不能编码此酶而碳源缺乏，生长被抑制。这样连着木糖异构酶基因的我们要转入的基因就会在那些生长良好的细胞中。我们进行选择后培养就能得到我们所要的转基因植株。 以糖类为筛选剂的筛选系统标记基因产物安全(编码的酶已广泛应用于食品工业)、筛选剂价格低廉、筛选程序简单、效果显著，而且转基因植株生长比较旺盛, 并且不影响转化植物的代谢平衡，有望成为安全性标记基因筛选系统的主流。 在植物基因工程近30年的发展历史中，选择标记基因的应用也经历了从单一到多样的发展过程。从开始的抗生素选择标记基因到今天各种作用机制的选择标记基因层出不穷。选择标记基因也逐渐向着更加安全、更加环保的方向发展。